Często zadawane pytania dotyczące zestawu do izolacji całkowitego RNA zwierząt/komórek

Poniższa analiza problemów, które możesz napotkać podczas ekstrakcji RNA z tkanek/komórek zwierzęcych, pomoże ci w eksperymentach.Ponadto w przypadku innych problemów eksperymentalnych lub technicznych, oprócz instrukcji obsługi i analizy problemów, oferujemy dedykowane wsparcie techniczne, które może Ci pomóc.Jeśli masz jakiekolwiek potrzeby, skontaktuj się z nami pod numerem: 028-83360257 lub e-mali: Tech@foregene.com.

RNA nie jest ekstrahowane lub wydajność RNA jest niska

Często istnieje wiele różnych czynników, które wpływają na wydajność odzyskiwania, takie jak: zawartość RNA w próbce tkankowej, metoda działania, objętość elucji itp.

1. Podczas pracy przeprowadzono łaźnię lodową lub wirowanie kriogeniczne (4°C).

Zalecenie: Przez cały proces eksploatować w temperaturze pokojowej (15-25°C), nie stosować kąpieli lodowej i wirować w niskich temperaturach.

2. Niewłaściwe przechowywanie próbki lub zbyt długi czas przechowywania próbki.

Zalecenie: Przechowuj próbki w temperaturze -80 °C lub zamrażaj w ciekłym azocie i unikaj wielokrotnego zamrażania-rozmrażania;spróbuj użyć świeżej tkanki lub hodowanych komórek do ekstrakcji RNA.

3. Niewystarczająca liza próbki.

Zalecenie: Podczas homogenizacji tkanki należy upewnić się, że tkanka jest wystarczająco zhomogenizowana i że komórki tkanki są wystarczająco podzielone, aby wyjaśnić uwalnianie RNA.

4. Eluent nie został prawidłowo dodany.

Zalecenie: Potwierdź, że ddH2O bez RNaz jest dodawany kroplami na środek membrany kolumny do oczyszczania.

5. Nie dodano odpowiedniej objętości etanolu absolutnego do Bufora RL2 lub Bufora RW2.

Zalecenie: Postępuj zgodnie z instrukcjami, dodaj odpowiednią objętość etanolu absolutnego do Bufora RL2 i Bufora RW2 i dobrze wymieszaj przed użyciem zestawu.

6. Dawkowanie próbki tkanki nie jest właściwe.

Zalecenie: Użyj 10-20 mg tkanki lub (1-5) × 106 komórek na 500 μl buforu RL1, ponieważ nadmierne użycie tkanki może skutkować zmniejszoną ekstrakcją RNA.

7. Niewłaściwa objętość elucji lub niepełna elucja.

Zalecenie: Objętość elucji kolumny oczyszczającej wynosi 50-200 μl;jeśli efekt elucji nie jest zadowalający, zaleca się wydłużenie czasu umieszczania w temperaturze pokojowej po dodaniu podgrzanej ddH2O bez RNaz, np. o 5-10 min.

8. Kolumna oczyszczająca zawiera pozostałość etanolu po przemyciu buforem RW2.

Zalecenie: Jeśli po przemyciu buforem RW2 są pozostałości etanolu, wirowanie pustej probówki przez 1 min, czas operacji wirowania pustej probówki można wydłużyć do 2 min lub kolumnę oczyszczającą można umieścić w temperaturze pokojowej na 5 min, aby odpowiednio usunąć pozostałości etanol.

Oczyszczony RNA ulega degradacji

Jakość oczyszczonego RNA zależy od takich czynników, jak konserwacja próbki, zanieczyszczenie RNazą, manipulacja itp.

1. Próbki tkanek nie są przechowywane na czas.

Zalecenie: Jeśli próbki tkanek lub komórki nie są używane w odpowiednim czasie po pobraniu, należy natychmiast poddać je kriokonserwacji w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie.Aby wyekstrahować RNA, w miarę możliwości używaj nowo pobranej próbki tkanki lub komórki.

2. Wielokrotne zamrażanie-rozmrażanie próbek tkanek.

Zalecenie: Podczas przechowywania próbek tkanek najlepiej jest pociąć je na małe kawałki w celu konserwacji i usunąć jeden z nich podczas ich używania, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania-rozmrażania próbki i degradacji RNA.

3. RNaza jest wprowadzana lub nie nosi się jednorazowych rękawiczek, masek itp. podczas operacji.

Zalecenie: Eksperymenty z ekstrakcją RNA najlepiej przeprowadzać w oddzielnych pokojach do manipulacji RNA, a tabelę należy wyczyścić przed eksperymentem.

Podczas eksperymentu noś jednorazowe rękawiczki i maski, aby zminimalizować degradację RNA spowodowaną wprowadzeniem RNazy.

4. Odczynniki są zanieczyszczone RNazą podczas użytkowania.

Zalecenie: Wymień na nowy zestaw Animal Total RNA Isolation Kit w przypadku powiązanych eksperymentów.

5. Probówki wirówkowe, końcówki itp. używane do manipulacji RNA są zanieczyszczone RNazą.

Zalecenie: Upewnij się, że probówki wirówkowe, końcówki, pipety itp. używane do ekstrakcji RNA są wolne od RNaz.

Oczyszczony uzyskany RNA wpływa na dalsze eksperymenty

RNA oczyszczone przez kolumnę oczyszczającą, jeśli jony soli, zawartość białka jest zbyt duża, wpłynie na dalszy eksperyment, taki jak: odwrotna transkrypcja, North Blot i in.

1. Eluowany RNA zawiera reszty jonów soli.

Zalecenie: Potwierdź, że do buforu RW2 dodano odpowiednią objętość etanolu i wykonaj 2 płukania kolumny oczyszczającej przy prędkości wirowania wskazanej dla działania;jeśli są jakiekolwiek pozostałości jonów soli, pozostaw kolumnę oczyszczającą w Buforze RW2 na 5 min w temperaturze pokojowej i przeprowadź wirowanie, aby zmaksymalizować usunięcie zanieczyszczeń solą.

2. Reszta etanolowa w wymytym RNA.

Zalecenie: Po przemyciu buforem RW2 należy potwierdzić, że należy wykonać operację wirowania pustej probówki ze wskazaną dla operacji prędkością wirowania, wydłużyć czas operacji wirowania pustej probówki do 2 min, jeśli pozostała jeszcze pozostałość etanolu, lub pozostawić ją w temperaturze pokojowej na 5 minut min po odwirowaniu pustej probówki, aby zmaksymalizować usunięcie pozostałości etanolu.