JAK ZWIĘKSZYĆ WYDAJNOŚĆ ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI LNCRNA?

Prowadzić

Długi niekodujący RNA, lncRNA to niekodujący RNA o długości większej niż 200 nukleotydów, zwykle między 200-100000 nt.lncRNA reguluje ekspresję genów na poziomie epigenetycznym, transkrypcyjnym i posttranskrypcyjnym oraz uczestniczy w wyciszaniu chromosomu X, imprintowaniu genomu i modyfikacji chromatyny, aktywacji transkrypcji, interferencji transkrypcji, transporcie jądrowym, regulacji cyklu komórkowego, regulacji różnicowania komórek i efektach kompensacji dawki (dawkowanie kompensacji) oraz wiele innych ważnych procesów regulacyjnych jest ściśle związanych z występowaniem, rozwojem i profilaktyką chorób człowieka i jest obecnie jednym z gorących punktów w dziedzinie biomedycyny.

01 Rodzaje i charakterystyka LncRNA

lncRNA dzieli się na wiele typów w zależności od różnych źródeł jego powstawania, jak pokazano na powyższym rysunku.Ma następujące cechy:

1. lncRNA są zwykle dłuższe, z dynamiczną ekspresją i różnymi metodami splicingu podczas różnicowania
2. W porównaniu z kodującymi genami lncRNA ma zwykle niższy poziom ekspresji
3. Większość lncRNA ma oczywistą czasową i przestrzenną specyficzność ekspresji w procesie różnicowania i rozwoju tkanek
4. W nowotworach i innych chorobach występują charakterystyczne wyrażenia
5. Lokalizacje subkomórkowe lncRNA są zróżnicowane
6. Sekwencja ma niską konserwację, ale funkcja ma pewien stopień konserwacji itp.

02 Często zadawane pytania dotyczące odwrotnej transkrypcji LncRNA

Ze względu na niską zawartość lncRNA w komórkach, dużą długość i wysoką strukturę, takie RNA często ma złożone struktury, takie jak pętle łodygi lub spinki do włosów, a RT-qPCR jest podatny na problemy z nieudaną odwrotną transkrypcją lub niską wydajnością.

03 Roztwór do odwrotnej transkrypcji LncRNA

Zgodnie z główną zasadą, proces wirusów RNA wykorzystujących własną odwrotną transkryptazę do syntezy DNA przy użyciu RNA jako matrycy nazywa się odwrotną transkrypcją.Proces wykorzystywania odwrotnej transkryptazy wirusa RNA do syntezy matrycy cDNA in vitro nazywa się odwrotną transkrypcją.Główne elementy wchodzące w skład systemu odwrotnej transkrypcji: matryca RNA, odwrotna transkryptaza, startery i inne składniki.

1. Szablon RNA

Wpływ matrycy RNA na odwrotną transkrypcję znajduje odzwierciedlenie w jej strukturze, czystości i integralności.Im wyższa czystość i integralność wyekstrahowanego RNA, tym wyższa wydajność odwrotnej transkrypcji i dokładniejsze późniejsze wyniki ilościowe.RNA oczyszczony przez powszechnie stosowane odczynniki do ekstrakcji RNA często zawiera pozostałości alkoholi i soli guanidyny, które mają silne działanie hamujące na większość odwrotnej transkryptazy.

2.Odwrotna transkryptaza

Odwrotna transkryptaza ma kluczowy wpływ na cały system odwrotnej transkrypcji.Odpowiednia temperatura dla odwrotnej transkryptazy stosowanej w większości laboratoriów wynosi na ogół 42°C.W rzeczywistości otwarcie wysokopoziomowej struktury RNA wymaga wyższej temperatury, a wymagania dotyczące odwrotnej transkryptazy są wyższe.

3.Podkład

Startery odwrotnej transkrypcji obejmują startery specyficzne dla genu, startery losowe i startery Oligo dT.Większość lncRNA nie zawiera ogonów poliA i ważne jest, aby odpowiednio dopasować losowe startery do Oligo dT.

4.Inne komponenty

W związku z tym, że RNA jest szczególnie łatwy do degradacji, wprowadzanie składników do systemu odwrotnej transkrypcji można zminimalizować, co może skutecznie zapobiegać wejściu RNazy i zapewnić płynny przebieg odwrotnej transkrypcji.

Foregene uzyskuje z szablonu RNA, odwrotną transkrypcję do qPCR Kompleksowo eskortuje wykrywanie lncRNA

Zestaw do izolacji Animal Total RNA (z kolumną do usuwania gDNA)

Zestaw Cell Total RNA Isolation Kit (z kolumną do usuwania gDNA)

Lnc-RT HeroTM I (z gDNazą) (Super Premiks do syntezy pierwszej nici cDNA z lncRNA)

Real Time PCR EasyTM-SYBR Zielony I

Zalety ekstrakcji RNA:

Zestaw wykorzystuje technologię ekstrakcji RNA trzeciej generacji, bez konieczności stosowania DNazy.

11 minut z 96, 24, 12 i 6-studzienkowych komórek hodowanych na płytce, wysoce wydajna ekstrakcja wolnego od gDNA, wysokiej czystości, wysokiej jakości całkowitego RNA komórek.

Zalety odwrotnej transkrypcji lncRNA:

System odwrotnej transkrypcji opracowany specjalnie dla LncRNA do szybkiego usuwania zanieczyszczeń genomowego DNA.

System odwrotnej transkrypcji ma wysoką stabilność termiczną i nadal ma dobrą wydajność odwrotnej transkrypcji w 50°C.

Szablony o wysokiej zawartości GC i złożonej strukturze drugorzędowej można odwrócić z wysoką wydajnością.

Zalety qPCR:

Hot start Foregene Taq Polymerase ma wyższą wydajność amplifikacji, wyższą czułość amplifikacji i wyższą specyficzność amplifikacji.

Zoptymalizowany Real PCR Easy Mix sprawia, że ​​SYBR Green I ma wyższą czułość detekcji, a intensywność fluorescencji jest 3-5 razy większa niż w przypadku podobnych produktów, które mogą zaspokoić potrzeby różnego rodzaju fluorescencyjnych eksperymentów ilościowych.