Przygotowanie ekstrakcji RNA i środki ostrożności

Sterylizacja końcówek do pipet i probówek EP itp.

1. Przygotuj 0,1% (jedna tysięczna) DEPC (substancja wysoce toksyczna) z wodą dejonizowaną, użyj ostrożnie pod wyciągiem i przechowuj w temperaturze 4°C z dala od światła;

Woda DEPC to czysta woda uzdatniona DEPC i sterylizowana w wysokiej temperaturze i pod wysokim ciśnieniem.Testowany na brak RNaz, DNaz i proteinazy.

2. Włóż końcówkę pipety i rurkę EP do 0,1% DEPC i upewnij się, że końcówka pipety i rurka EP są wypełnione 0,1% DEP.

3. Chronić przed światłem, odstawić na noc (12-24h)

4. Pudełko zawierające końcówkę i rurkę EP nie musi być moczone w DEPC.Po wstępnym usunięciu wody DEPC z końcówki lub rurki EP zapakuj ją i zawiń.

5. 121 stopni Celsjusza, 30 min

6. 180 stopni Celsjusza, susz przez kilka godzin (minimum 3 godziny)

Nie herbata.Podczas pracy z DEPC noś lateksowe rękawiczki i maski!b lub bez sterylizacji DEPC, 130 ℃, autoklaw 90 min (wiele laboratoriów sterylizacja w wysokiej temperaturze dwukrotnie)

Uwagi dotyczące ekstrakcji RNA

Dwa główne zjawiska tkankowego RNAizolacjaawaria

Degradacja RNA i pozostałości zanieczyszczeń w tkankach,Jeśli chodzi o degradację, przyjrzyjmy się najpierw, dlaczego RNA wyekstrahowany z hodowanych komórek nie ulega łatwej degradacji.Wszystkie istniejące odczynniki do ekstrakcji RNA zawierają składniki, które szybko hamują RNazę.Dodaj lizat do hodowanych komórek i po prostu wymieszaj, wszystkie komórki mogą być dokładnie wymieszane z lizatem i komórki są całkowicie zlizowane.Po lizie komórek składniki aktywne w lizacie natychmiast hamują wewnątrzkomórkową RNazę, dzięki czemu RNA pozostaje nienaruszone.To znaczy, ponieważ hodowane komórki łatwo iw pełni kontaktują się z lizatem, ich RNA nie ulega łatwej degradacji;z drugiej strony RNA w tkance łatwo ulega degradacji, ponieważ komórki w tkance nie mają łatwego szybkiego kontaktu z lizatem.ze względu na wystarczający kontakt.Więc,zakładając, że istnieje sposób na przekształcenie tkanki w pojedynczą komórkę, jednocześnie hamując aktywność RNA, problem degradacji można całkowicie rozwiązać.

Najskuteczniejszą taką metodą jest mielenie w ciekłym azocie.Jednak metoda mielenia w ciekłym azocie jest bardzo kłopotliwa, zwłaszcza przy dużej ilości próbek.To dało początek kolejnej najlepszej rzeczy: homogenizatorowi.ThehomogenizatorMetoda nie bierze pod uwagę kwestii, w jaki sposób aktywność RNazy jest hamowana przed kontaktem komórek z lizatem, ale raczej modli się, aby tempo rozrywania tkanki było szybsze niż tempo, z jakim wewnątrzkomórkowa RNaza degraduje RN.

Efekt homogenizatora elektrycznego jest lepszy,a efekt homogenizatora szklanego jest słaby, ale ogólnie metoda homogenizatora nie może zapobiec zjawisku degradacji.Dlatego też, jeśli ekstrakcja ulegnie degradacji, do rozdrabniania ciekłym azotem należy użyć oryginalnego homogenizatora elektrycznego;oryginalny homogenizator szklany należy zmienić na homogenizator elektryczny lub bezpośrednio zmielić ciekłym azotem.Problem jest prawie w 100% wykonalny.rozwiązać.

Problem pozostałości zanieczyszczeń, który ma wpływ na kolejne eksperymenty, ma bardziej zróżnicowane przyczyny niż degradacja, a rozwiązania są odpowiednio różne.Podsumowując,jeżeli w tkance występuje degradacja lub resztkowe zanieczyszczenia, należy zoptymalizować metodę ekstrakcji/odczynnik dla określonego materiału doświadczalnego.Nie musisz używać swoich cennych próbek do optymalizacji: możesz kupić kilka małych zwierząt, takich jak ryba/kurczak z rynku, pobrać odpowiednią część materiału do ekstrakcji RNA, a drugą część do ekstrakcji białka - zmielić ustami, Ekstrakt z żołądka i jelit.

Docelowy RNA z wyekstrahowanego RNA jest używany w różnych dalszych eksperymentach, a jego wymagania dotyczące jakości są różne

Konstrukcja biblioteki cDNA wymaga integralności RNA bez pozostałości inhibitorów reakcji enzymatycznych;Northern wymaga wyższej integralności RNA i niższych wymagań dla reszt inhibitorów reakcji enzymatycznych;RT-PCR nie wymaga zbyt wysokiej integralności RNA,ale hamuje reakcje enzymatyczne.Wymagania dotyczące pozostałości są surowe.Wejście określa wyjście;za każdym razem, gdy celem jest uzyskanie RNA o najwyższej czystości, będzie to kosztować ludzi i pieniądze.

Pobieranie/przechowywanie próbek

Czynniki wpływające na degradację Po tym, jak próbka opuści żywe ciało/lub pierwotne środowisko wzrostu, endogenne enzymy w próbce zaczną degradować RNA,a szybkość degradacji jest związana z zawartością enzymów endogennych i temperaturą.Tradycyjnie istnieją tylko dwa sposoby na całkowite zahamowanie aktywności enzymów endogennych: natychmiastowe dodanie lizatu oraz dokładne i szybkie homogenizowanie;pokroić na małe kawałki i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.Oba podejścia wymagają szybkiego działania.Ta ostatnia jest odpowiednia dla wszystkich próbek, podczas gdy ta pierwsza jest odpowiednia tylko dla tkanek o niskiej zawartości komórek i enzymów endogennych i łatwiejsza do homogenizacji.W szczególności tkankę roślinną, wątrobę, grasicę, trzustkę, śledzionę, mózg, tłuszcz, tkankę mięśniową itp. najlepiej zamrozić ciekłym azotem przed kontynuowaniem.

Fragmentacja i homogenizacja próbek

Czynniki wpływające na degradację i fragmentację próbki plonu todo dokładnej homogenizacji, który służy do całkowitego i całkowitego uwolnienia RNA.Komórki mogą być bezpośrednio homogenizowane bez pękania.Tkanki mogą być homogenizowane dopiero po rozbiciu.Drożdże i bakterie należy rozbić odpowiednimi enzymami, zanim będą mogły zostać zhomogenizowane.Tkanki o niższej zawartości enzymów endogennych i łatwiejszej homogenizacji można jednorazowo kruszyć i homogenizować w lizacie za pomocą homogenizatora;tkanka roślinna, wątroba, grasica, trzustka, śledziona, mózg, tłuszcz, tkanka mięśniowa i inne próbki, albo mają wysoką zawartość enzymów endogennych, albo nie są łatwo homogenizowane,dlatego rozerwanie tkanek i homogenizacja muszą być wykonywane oddzielnie.Najbardziej niezawodną i najbardziej wydajną metodą rozdrabniania jest mielenie ciekłym azotem, a najbardziej niezawodną metodą homogenizacji jest zastosowanie homogenizatora elektrycznego.Specjalna uwaga dotycząca mielenia w ciekłym azocie: próbki nie wolno rozmrażać podczas całego procesu mielenia, ponieważ endogenne enzymy mają większe szanse na działanie po zamrożeniu.

Wybór lizatu

Wpływanie na wygodę obsługi i czynniki resztkowych zanieczyszczeń endogennych Powszechnie stosowane roztwory do lizy mogą prawie hamować aktywność RNazy.Dlatego kluczowym punktem wyboru roztworu do lizy jest rozważenie w połączeniu z metodą oczyszczania.Jest jeden wyjątek:W przypadku próbek o wysokiej zawartości enzymów endogennych zaleca się stosowanie lizatu zawierającego fenol w celu zwiększenia zdolności do inaktywacji enzymów endogennych.

Wybór metody oczyszczania

Czynniki wpływające na resztkowe zanieczyszczenia endogenne, szybkość ekstrakcji W przypadku czystych próbek, takich jak komórki, zadowalające wyniki można uzyskać za pomocą prawie każdej dostępnej metody oczyszczania.Jednak w przypadku wielu innych próbek, zwłaszcza tych o wysokim poziomie zanieczyszczeń, takich jak rośliny, wątroba, bakterie itp., wybór odpowiedniej metody oczyszczania ma kluczowe znaczenie.Metoda oczyszczania wirówkowego w kolumnie charakteryzuje się dużą szybkością ekstrakcji i może skutecznie usuwać zanieczyszczenia, które wpływają na późniejszą reakcję enzymatyczną RNA, ale jest kosztowna (Foregene oferuje niedrogie zestawy, więcej szczegółów kliknijtutaj);stosując ekonomiczne i klasyczne metody oczyszczania, takie jak strącanie LiCl, można również uzyskać zadowalające wyniki, ale czas działania jest długi..

„Trzy dyscypliny i osiem uwag” do ekstrakcji RNA

Dyscyplina 1: Połóż kres zanieczyszczeniu enzymami egzogennymi.

Notatka 1:Ściśle noś maski i rękawiczki.

Uwaga 2:Probówki wirówkowe, głowice do końcówek, pręty do pipet, zbiorniki do elektroforezy i stanowiska doświadczalne biorące udział w eksperymencie należy dokładnie zutylizować.

Uwaga 3: Odczynniki/roztwory biorące udział w eksperymencie, zwłaszcza woda, muszą być wolne od RNaz.

Dyscyplina 2:Blokuj aktywność enzymów endogennych

Uwaga 4:Wybierz odpowiednią metodę homogenizacji.

Uwaga 5:Wybierz odpowiedni lizat.

Uwaga 6:Kontroluj początkową ilość próbki.

Dyscyplina 3: Wyjaśnij swój cel ekstrakcji

Uwaga 7:Przy każdym systemie lizatu zbliżającym się do maksymalnej wyjściowej ilości próbki, wskaźnik powodzenia ekstrakcji gwałtownie spada.

Uwaga 8:Jedynym ekonomicznym kryterium udanej ekstrakcji RNA jest sukces w kolejnych eksperymentach, a nie wydajność.

10 najważniejszych źródeł skażenia RNazami

1. Palce są pierwszym źródłem enzymów egzogennych, dlatego rękawice muszą być często noszone i wymieniane.Ponadto należy również nosić maski, ponieważ oddychanie jest również ważnym źródłem enzymów.Dodatkową korzyścią z noszenia maski w rękawiczce jest ochrona eksperymentatora.

2. Końcówki do pipet, probówki wirówkowe, pipety – RNazy nie mogą być dezaktywowane przez samą sterylizację, dlatego końcówki do pipet i probówki wirówkowe powinny być traktowane DEPC, nawet jeśli są oznaczone jako poddane obróbce DEPC.Najlepiej użyć pipety specjalnego przeznaczenia, przed użyciem wytrzeć ją wacikiem z 75% alkoholu, zwłaszcza prętem;ponadto pamiętaj, aby nie używać ściągacza do głowy.

3. Woda/bufor musi być wolny od zanieczyszczenia RNazą.

4. Przynajmniej stół testowy należy wytrzeć do czysta wacikami z 75% alkoholu.

• RNaza endogenna Wszystkie tkanki zawierają enzymy endogenne, dlatego szybkie zamrożenie tkanek ciekłym azotem jest najlepszym sposobem na ograniczenie degradacji.Metoda przechowywania/rozdrabniania ciekłego azotu jest rzeczywiście niewygodna, ale jest to jedyny sposób w przypadku tkanek o wysokim poziomie enzymów endogennych.

6. Próbki RNA Produkty ekstrakcji RNA mogą zawierać ślady zanieczyszczenia RNazą.

7. Ekstrakcja plazmidu Ekstrakcja plazmidu często wykorzystuje Rnazę do degradacji RNA, a resztkowa Rnaza powinna być trawiona proteinazą K i ekstrahowana przez PCI.

8. Przechowywanie RNA Nawet jeśli jest przechowywany w niskiej temperaturze, śladowe ilości RNazy spowodują degradację RNA.Najlepszym rozwiązaniem dla długoterminowej konserwacji RNA jest zawiesina soli/alkoholu, ponieważ alkohol hamuje wszelką aktywność enzymatyczną w niskich temperaturach.

9. Gdy kationy (Ca, Mg) zawierają te jony, ogrzewanie w temperaturze 80C przez 5 minut spowoduje rozszczepienie RNA, więc jeśli RNA musi zostać podgrzane, roztwór konserwujący musi zawierać środek chelatujący (1mM cytrynian sodu, pH 6,4 ).

10. Enzymy użyte w kolejnych eksperymentach mogą być zanieczyszczone RNazą.

10 wskazówek dotyczących ekstrakcji RNA

1: Szybko zapobiegaj aktywności RNazy.Próbki są szybko zamrażane po pobraniu, a RNaza jest inaktywowana przez szybkie działanie podczas lizy.

2: Wybierz odpowiednią metodę ekstrakcji dla tkanki o wysokiej zawartości rybozymu, a tkankę tłuszczową najlepiej zastosować metodę zawierającą fenol.

3: Jakość przewidywania wymaga Northern, konstrukcja biblioteki cDNA wymaga wysokiej integralności, a RT-PCR i RPA (test ochrony rybonukleazy) nie wymagają wysokiej integralności.RT-PCR wymaga wysokiej czystości (reszty inhibitora enzymu).

4: Dokładna homogenizacja jest kluczem do poprawy wydajności i zmniejszenia degradacji.

5: Sprawdź integralność detekcji elektroforezy RNA, 28S:18S = 2:1 to całkowity znak, 1:1 jest również dopuszczalne w większości eksperymentów.

6: Usunięcie DNA do RT-PCR, analiza macierzowa Do usunięcia DNA najlepiej jest użyć DNAzy I.

7: Zmniejsz zanieczyszczenie enzymami egzogennymi - enzymy nie mogą być importowane z zewnątrz.

8: Podczas zatężania kwasu nukleinowego o niskim stężeniu należy dodać odczynnik współstrącający.Ale aby zapobiec współwytrącaniu zawierającemu enzymy i skażeniu DNA.

9: Dokładnie rozpuść RNA, jeśli to konieczne, ogrzewaj w 65°C przez 5 minut.

odpowiednia metoda przechowywania

Może być przechowywany w temperaturze –20C przez krótki czas, a w –80C przez długi czas.Pierwszym krokiem do poprawy wydajności RNA jest uświadomienie sobie, że zawartość RNA w różnych próbkach jest bardzo zróżnicowana.Wysoka obfitość (2-4 ug/mg) np. wątroba, trzustka, serce, średnia obfitość (0,05-2 ug/mg) np. mózg, zarodek, nerki, płuca, grasica, jajnik, niska obfitość (<0,05 ug/mg) mg ) takich jak pęcherz, kość, tłuszcz.

1: Zlizuj komórki, aby uwolnić RN – jeśli RNA nie zostanie uwolnione, wydajność zostanie zmniejszona.Homogenizacja elektryczna działa lepiej niż inne metody homogenizacji, ale może również wymagać połączenia z innymi metodami, takimi jak zacieranie ciekłym azotem, trawienie enzymatyczne (lizozym/lyticase)

2: Optymalizacja metody ekstrakcji.Największymi problemami związanymi z metodami fenolowymi jest niepełna stratyfikacja i częściowa utrata RNA (nie można całkowicie usunąć supernatantu).Niepełna stratyfikacja jest spowodowana wysoką zawartością kwasów nukleinowych i białka, którą można rozwiązać, zwiększając ilość użytego lizatu lub zmniejszając ilość próbki.Do tkanki tłuszczowej dodano etap ekstrakcji chloroformem.Utratę RNA można zmniejszyć przez pompowanie wsteczne lub usunięcie warstwy organicznej, a następnie odwirowanie.Największym problemem metod opartych na wirowaniu kolumnowym jest nadmiar próbki.

Klasyczne wskazówki dotyczące ekstrakcji

1. Oczyszczanie fenolu: Dodaj równą objętość 1:1 fenol/chloroform i mieszaj energicznie przez 1-2 minuty.Wiruj z dużą prędkością przez 2 minuty.Ostrożnie usunąć supernatant (80-90%).Nigdy nie wchodź do środkowej warstwy.Równą objętość roztworu reakcyjnego można dodać do fenolu/chloroformu i supernatant usunąć.Dwa supernatanty można mieszać razem w celu wytrącenia kwasu nukleinowego w celu poprawy wydajności.Nie mieszaj zbyt delikatnie i nie próbuj usuwać całego supernatantu.

2. Płukanie 70-80% etanolem: Podczas płukania kwas nukleinowy musi zostać zawieszony, aby zapewnić wypłukanie pozostałości soli.Jednocześnie natychmiast po odlaniu etanolu wiruj z dużą prędkością przez kilka sekund, a następnie usuń resztki etanolu za pomocą pipety.Rozpuścić po odstawieniu w temperaturze pokojowej na 5-10 minut.

11. Wydobycie organizacji specjalnych

1. Tkanka włóknista: Kluczem do ekstrakcji RNA z tkanki włóknistej, takiej jak serce/mięsień szkieletowy, jest całkowite zniszczenie tkanki.Tkanki te mają niską gęstość komórek, więc ilość RNA na jednostkę masy tkanki jest niska i najlepiej jest użyć tak dużej ilości wyjściowej, jak to możliwe.Pamiętaj, aby dokładnie zmielić tkankę w warunkach zamrażania.

2. Tkanki o wysokiej zawartości białka/tłuszczu: zawartość tłuszczu w mózgu/roślinach jest wysoka.Po ekstrakcji PCI supernatant zawiera białe kłaczki.Supernatant należy ponownie wyekstrahować chloroformem.

3. Tkanki o wysokiej zawartości kwasu nukleinowego/rybozymu: śledziona/grasica ma wysoką zawartość kwasu nukleinowego i rybozymu.Zmielenie tkanki w warunkach zamrażania, a następnie szybka homogenizacja może skutecznie inaktywować rybozymy.Jednakże, jeśli lizat jest zbyt lepki (z powodu wysokiej zawartości kwasu nukleinowego), ekstrakcja PCI nie będzie w stanie skutecznie rozwarstwić;dodanie większej ilości lizatu może rozwiązać ten problem.Wielokrotne ekstrakcje PCI mogą usunąć więcej pozostałości DNA.Jeśli zaraz po dodaniu alkoholu tworzy się biały osad, oznacza to zanieczyszczenie DNA.Ponowna ekstrakcja za pomocą kwaśnego PCI po rozpuszczeniu może usunąć zanieczyszczenie DNA.

4. Tkanka roślinna: Tkanka roślinna jest bardziej złożona niż tkanka zwierzęca.Generalnie rośliny są mielone w warunkach ciekłego azotu, więc degradacja RNA przez enzymy endogenne jest rzadkością.Jeśli problem degradacji nie zostanie rozwiązany, prawie na pewno jest to spowodowane zanieczyszczeniami zawartymi w próbce.Zanieczyszczenia zawarte w wielu roślinach będą prowadzić do pozostałości, a przyczyną pozostałości jest często to, że te zanieczyszczenia mają pewne podobieństwo do RNA: wytrącasz i ja strącasz, a ty adsorbujesz i ja adsorbujesz.Te cechy decydują o tym, że są bardzo silnymi inhibitorami enzymów.

Obecnie komercyjne odczynniki do ekstrakcji RNA można dostosować do prawie wszystkich tkanek zwierzęcych z niewielkimi modyfikacjami, ale istnieje niewiele komercyjnych odczynników do ekstrakcji RNA, które mogą być odpowiednie dla większości tkanek roślinnych.Na szczęście Foregene może zapewnić wyjątkowe Mamy zestawy do ekstrakcji RNA roślinZestaw do izolacji całkowitego RNA roślin,Zestaw do izolacji całkowitego RNA roślin Plus.Ta ostatnia jest specjalnie zaprojektowana dla roślin o wysokiej zawartości polisacharydów i polifenoli.W przypadku ekstrakcji RNA opinie użytkowników laboratorium są szczególnie dobre.

12. Efekt zamrażania i rozmrażania próbki Zamrożona próbka może być większa i należy ją pociąć przed użyciem do ekstrakcji RNA.Próbki mają tendencję do topienia się (prawdopodobnie częściowo) podczas cięcia.Zamrożone próbki mogą wymagać zważenia przed ekstrakcją RNA, a podczas tego procesu na pewno nastąpi rozmrożenie.Czasami rozmrażanie próbki występuje również podczas procesu mielenia w ciekłym azocie;lub zamrożoną próbkę dodaje się bezpośrednio do lizatu bez mielenia w ciekłym azocie, a rozmrażanie na pewno nastąpi przed całkowitą homogenizacją.Eksperymenty wykazały, że zamrożona tkanka jest bardziej podatna na degradację RNA podczas rozmrażania niż tkanka świeża.Prawdopodobny powód: proces zamrażania-rozmrażania niszczy struktury w komórce, ułatwiając endogennym enzymom bezpośredni kontakt z RNA.

13. Ocena jakości RNA Zwykle do oceny integralności RNA stosuje się elektroforezę, a do oceny czystości RNA stosuje się A260/A280.Teoretycznie nienaruszony RNA ma stosunek 28S:18S = 2,7:1, a większość danych podkreśla stosunek 28S:18S = 2:1.Faktem jest, że prawie żaden RNA wyekstrahowany z próbek innych niż komórki nie jest w stosunku 2:1 (uzyskano to przy użyciu Agilent Bioanalyzer).

Na wyniki elektroforezy RNA wpływa wiele czynników, w tym struktura drugorzędowa, warunki elektroforezy, obciążenie próbki, stopień nasycenia przez EB itp. Użyj natywnej elektroforezy do wykrywania RNA i użyj markera DNA jako kontroli.Jeśli 28S przy 2kb i 18S przy 0,9kb są jasne, a 28S: 18S > 1, integralność może spełnić wymagania większości kolejnych eksperymentów.

A260/A280 to wskaźnik, który wywołał spore zamieszanie.Przede wszystkim należy wyjaśnić pierwotne znaczenie tego wskaźnika dla kwasów nukleinowych: czysty RNA, jego A260/280 = około 2,0.Czysty RNA jest „przyczyną”, a A260/A280 = 2 jest „skutkiem”.Teraz wszyscy używają A260/A280 jako „przyczyny”, myśląc, że „jeśli A260/A280 = 2, to RNA jest czyste”, co naturalnie prowadzi do zamieszania.

Jeśli jesteś zainteresowany, możesz dodać trochę odczynnika, który jest często używany w ekstrakcji, takiego jak fenol, izotiocyjanian guanidyny, PEG itp., do próbki RNA, a następnie zmierzyć stosunek A260/A280.W rzeczywistości wiele odczynników używanych do ekstrakcji RNA, a także wiele zanieczyszczeń w próbce, absorbuje około A260 i A280, wpływając na A260/A280.

Obecnie najbardziej pouczającym podejściem jest skanowanie próbek RNA w zakresie 200-300 nm.Krzywa czystego RNA ma następujące cechy: krzywa jest gładka, A230 i A260 to dwa punkty przegięcia, A300 jest bliskie 0, A260/A280 = około 2,0 i A260/A230 = około 2,0.Jeśli dane skanowania nie są dostępne, należy również określić stosunek A260/A230, ponieważ stosunek ten jest bardziej wrażliwy na przenoszenie wszystkich zanieczyszczeń, które wpływają na reakcję enzymatyczną.Weź pod uwagę zakres liniowy urządzenia (0,1–0,5 dla A260).

Istnieją dwa inne przydatne zjawiska: stosunek będzie o około 0,3 niższy, gdy A260/A280 jest mierzony w wodzie;natomiast stosunek mierzony w 10 mM EDTA jest o około 0,2 wyższy niż ten mierzony w 1 mM EDTA.