RT-QPCR EasyTM I One Step SYBR Green I Kompletne ilościowe wykrywanie genów dla RT i Real Time PCR

RT-QPCR EasyTM I (One Step)-SYBR Green I szybko kończę ilościowe wykrywanie genów w RT i Real Time PCR

RT-qPCR EasyTM (jednoetapowy)-SYBR zielony I

Nr kat.RT-02111/02112

Jednoetapowy miks RT-PCR w czasie rzeczywistym

Wyłącznie do celów badawczych

Przechowywać w temperaturze -20 ℃

Wprowadzenie produktów

RT-qPCR EasyTM (One Step)-SYBR Green I Wykorzystuje unikalny system do skutecznego łączenia reakcji RT i Real Time PCR, co może szybko zakończyć ilościowe wykrywanie genów.Produkt posiada silną tolerancję, wysoką specyficzność i stabilność.Produkt zawiera unikalną polimerazę Foregene HotStar Taq DNA Polymerase, która ma zalety szybszej amplifikacji (2Kb/min), wysokiej wydajności amplifikacji, silnej specyficznej zdolności amplifikacji i niskiego wskaźnika niedopasowania w porównaniu ze zwykłymi enzymami Taq.Jest on tutaj używany do RT-PCR w czasie rzeczywistym w celu zmniejszenia niespecyficznej amplifikacji i poprawy dokładności PCR.

Cechy

Jednoetapowy zestaw umożliwia odwrotną transkrypcję i qPCR dwie reakcje w tej samej probówce, wystarczy dodać matrycowy RNA, specyficzne startery PCR i ddH2O bez RNaz.

Zestaw umożliwia szybką i wydajną analizę ilościową wirusowego RNA lub śladowego RNA.

Zestaw wykorzystuje unikalny odczynnik Foregene do odwrotnej transkrypcji oraz polimerazę Foregene HotStar Taq DNA w połączeniu z unikalnym systemem reakcji, aby skutecznie poprawić wydajność amplifikacji i specyficzność reakcji.

Zoptymalizowany system reakcji sprawia, że ​​reakcja ma wyższą czułość wykrywania, silniejszą stabilność termiczną i lepszą tolerancję.

Zestaw RT-qPCR EasyTM (One Step)-SYBR Green I jest dostarczany z wewnętrznym barwnikiem referencyjnym ROX, którego można użyć do wyeliminowania tła sygnału i błędów sygnału między dołkami, co jest wygodne dla klientów w użyciu w różnych modelach przyrządów do ilościowego PCR.

Zawartość zestawu

Warunki transportu i przechowywania

1. Warunki transportu

Cały proces transportu lodówek w niskich temperaturach, aby zapewnić, że zestaw jest w stanie <4 °C.

2. Warunki przechowywania

• Zestaw jest przechowywany w temperaturze -20 ℃.Przechowuj produkt w lodówce o stałej temperaturze w temperaturze -20 ℃ natychmiast po otrzymaniu.Jeśli warunki przechowywania są odpowiednie, produkt nie pogorszy żadnej wydajności w okresie ważności 1 roku.
• 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR składnik zawiera SYBR Green I, należy go przechowywać z dala od światła.

Informacje o komponentach zestawu

2× RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR:Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Foregene HotStar Taq DNA Polymerase, zoptymalizowany stosunek dNTPs, SYBR GreenI, Mg2+, stabilizatory, wzmacniacze i optymalizatory.

ROX Reference Dye: jest zwykle stosowany we wzmacniaczach Real Time PCR firm takich jak ABI i Stratagene w celu dostosowania różnicy między probówkami PCR a probówkami spowodowanej błędami ładowania próbki PCR.Stężenie barwnika referencyjnego ROX wymagane przez różne instrumenty jest różne, a użytkownik może go dodać zgodnie z zalecanym stężeniem instrumentu.

Środki ostrożności: (Przeczytaj uważnie środki ostrożności przed użyciem zestawu)

Odczynniki powinny unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, w przeciwnym razie działanie odczynników zmniejszy się lub stanie się nieważne.

Odczynniki w zestawie należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze -20°C.

Zaleca się stosowanie ekstrakcji świeżej próbki lub matrycowego RNA przechowywanego w temperaturze -80°C (RNA powinno unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania).

Aby uniknąć zanieczyszczenia RNazami, należy przeprowadzić eksperyment w przestrzeni wolnej od RNaz;używane końcówki do pipet i probówki do PCR muszą być wolne od RNaz;i nosić jednorazowe rękawiczki i maski.

Ten zestaw musi być używany z określonymi starterami do eksperymentów.Proszę wybrać specyficzne startery dla genu do amplifikacji zgodnie z potrzebami eksperymentu.

Przed użyciem umieść 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR I na lodzie, aby całkowicie się stopił, strzepnij i dobrze wymieszaj przed użyciem;przygotowanie systemu powinno odbywać się w łaźni lodowej, aby poprawić działanie zestawu i zwiększyć amplifikację PCR Specyficzność.

2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR zawiera SYBR Green I, należy unikać silnego światła.

Stężenie wzorcowego RNA

RT-qPCR EasyTM (jednoetapowy)-SYBR Green I: (0,1 pg-100 ng całkowitego RNA)/20 μl system.

Przewodnik po operacjach

A: Przygotowanie materiałów i odczynników

1. Przygotuj przygotowaną matrycę RNA (zaleca się użycie zestawów serii Foregene Total RNA Isolation Kit do ekstrakcji i oczyszczania RNA), specyficzne startery (10 μM) oraz powiązane materiały eksploatacyjne i instrumenty.

Uwaga: Upewnij się, że RNA jest integralne i spróbuj użyć RNA wyekstrahowanego ze świeżych próbek.

2. Umieść 2xRT-qPCR EasyTM Mix-SYBR, ddH2O bez RNaz i 50xROX Reference Dye (jeśli to konieczne) na lodzie, aby naturalnie się stopił, a następnie przetrzyj ścianki probówki, aby wymieszać aż do użycia.

B: Przygotowanie systemu RT-qPCR

2× RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR jest wygodny i szybki w użyciu, w największym stopniu pozwala uniknąć zanieczyszczeń podczas pracy i błędów doświadczalnych spowodowanych wielokrotnym przygotowywaniem układu reakcyjnego.Używając tylko połowę objętości układu reakcyjnego (na przykład, jeśli układ reakcyjny ma 20 μl, weź 10 μl roztworu 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR), dodaj matrycę RNA i specyficzne startery oraz dodaj ddH2O bez RNaz do uzupełnij objętość.W Tabeli 1 poniżej przedstawiono przygotowanie konkretnego układu reakcyjnego RT-qPCR

Formularz 1: Przygotowanie systemu RT-qPCR

1*: Zwykle końcowe stężenie podkładu wynosi 0,2-0,25 μM, aby uzyskać lepsze wyniki.Gdy wydajność reakcji jest słaba, stężenie podkładu można regulować w zakresie 0,1-0,5 μM.

Uwaga: Forward Primer i Reverse Primer są starterami specyficznymi dla genu docelowego.

2*: Wybierz odpowiednie stężenie końcowe barwnika referencyjnego ROX zgodnie z różnymi ilościowymi instrumentami PCR.Optymalne stężenie barwnika referencyjnego ROX dla popularnych maszyn do ilościowego PCR przedstawiono w poniższej tabeli:

C: Ustawienie systemu reakcji RT-qPCR

• Po przygotowaniu systemu RT-qPCR zgodnie z powyższą tabelą należy delikatnie wymieszać (można użyć końcówki pipety do delikatnego pipetowania; można też mieszać na worteksie i krótko wirować w celu zebrania płynu rozsypanego na ściance probówki lub korku probówki, i umieść na pojemniku na lód do późniejszego użycia).

2. Zapoznaj się z ustawieniami programu reakcji RT-qPCR (Tabela 2), aby ustawić temperaturę i czas reakcji.

Uwaga: Aby zapewnić aktywność 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR i poprawić jego skuteczność amplifikacji, najlepiej przygotować układ reakcyjny RT-qPCR po skonfigurowaniu programu aparatu PCR, aby program reakcji mógł być wprowadzane natychmiast po zakończeniu przygotowania systemu.

3. Aby uzyskać najlepszy efekt qPCR, można zastosować gradient PCR do optymalizacji warunków reakcji dla różnych matryc i różnych starterów.

Uwaga: Zakres temperatury przedłużenia dla polimerazy Foregene Hotstar Taq DNA Polymerase zawartej w tym zestawie wynosi: 60-72 ℃, a najlepsza temperatura przedłużenia to 72 ℃.

Poniżej przedstawiono przykład warunków reakcji RT-qPCR.Zaleca się stosowanie metody dwuetapowej do reakcji PCR.Gdy stężenie matrycy jest zbyt niskie, aby spowodować nieswoistą amplifikację, niska wartość Tm startera prowadzi do niskiej wydajności amplifikacji lub słabej powtarzalności krzywej amplifikacji itp., zaleca się wypróbowanie trzyetapowej metody reakcji PCR.Patrz Tabela 2-1 (metoda dwuetapowa) i Tabela 2-2 (metoda trzyetapowa) w celu ustalenia warunków reakcji RT-qPCR.

Formularz 2-1: Ustawienie programu reakcji RT-qPCR (dwuetapowy)

Formularz 2-2: Ustawienie programu reakcji RT-qPCR (trzy kroki)

1*: Czas odwrotnej transkrypcji można dostosować do potrzeb eksperymentalnych.Ogólne endogenne geny, takie jak β-aktyna, potrzebują tylko 10 minut;w celu wykrycia określonych genów ulegających ekspresji, czas odwrotnej transkrypcji można odpowiednio wydłużyć w razie potrzeby.

2*: Ustaw konkretny czas zgodnie z długością amplifikowanego fragmentu docelowego.Szybkość amplifikacji polimerazy Foregene HotStar Taq DNA wynosi 2 kb/min.

Uwaga: Warunki reakcji PCR różnią się w zależności od warunków strukturalnych matrycy, starterów itp. W przypadku matryc RNA ze złożonymi strukturami drugorzędowymi zaleca się użycie 42℃ w pierwszym etapie odwrotnej transkrypcji.W konkretnej operacji konieczne jest zaprojektowanie optymalnych warunków reakcji zgodnie z określonymi warunkami, takimi jak wielkość fragmentu docelowego, sekwencja zasad amplifikowanego fragmentu oraz zawartość GC i długość startera, w tym temperatura hybrydyzacji, wydłużanie czas itp.

Schemat działania