RT-QPCR EasyTM Taqman Jednoetapowy Master Mix RT-PCR w czasie rzeczywistym

RT-qPCR EasyTM (jeden krok)-Taqman

Do PCR w czasie rzeczywistym z użyciem cDNA, oczyszczonego DNA

Wprowadzenie produktów

Produkty serii Foregene One-Step RT-PCR Easy realizują zintegrowaną reakcję od RNA do dwuniciowego DNA, co oznacza, że ​​odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR są realizowane w tej samej probówce wirówki reakcyjnej i tym samym systemie reakcyjnym, dzięki czemu etapy eksperymentalne są uproszczone, zoptymalizowano plan eksperymentu i poprawiono wydajność eksperymentu.

RT-qPCR EasyTM (One Step)-Taqman przy użyciu polimerazy Foregene HotStar Taq DNA Polymerase, zoptymalizowany system Taqman qPCR może szybko i konkretnie przeprowadzić ilościową detekcję śladowych matryc RNA metodą RT-qPCR w czasie rzeczywistym.

Warunki transportu i przechowywania

• Warunki transportu: Cały proces jest transportowany w lodówce o niskiej temperaturze, aby zapewnić, że zestaw jest w stanie <4°C.
• Warunki przechowywania: Zestaw jest przechowywany w temperaturze -20 ℃.Przechowuj produkt w lodówce o stałej temperaturze w temperaturze -20 ℃ natychmiast po otrzymaniu.Jeśli warunki przechowywania są odpowiednie, produkt nie pogorszy żadnej wydajności w okresie ważności 1 roku.

Informacje o komponentach zestawu

• 2x RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman: Foregene Reverse Transcriptase, RNas Inhibitor, Foregene HotStar Taq DNA Polymerase, zoptymalizowany stosunek dNTPs, Mg2+, stabilizator, wzmacniacz i optymalizator.
• ROX Reference Dye: Zwykle stosowany w termocyklerach Real Time PCR firm takich jak ABI, Stratagene itp., w celu dostosowania różnicy między probówkami PCR spowodowanej błędami ładowania próbki PCR.Stężenie barwnika referencyjnego ROX wymagane przez różne instrumenty jest różne, a użytkownik może go dodać zgodnie z zalecanym stężeniem instrumentu.

Środki ostrożności:

u Odczynników należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, w przeciwnym razie działanie odczynników zmniejszy się lub stanie się nieważne.

u Odczynniki w zestawie należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze -20°C.

u Zaleca się stosowanie ekstrakcji świeżej próbki lub matrycowego RNA przechowywanego w temperaturze -80°C (RNA powinno unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania).

u Aby uniknąć zanieczyszczenia RNazami, należy przeprowadzić eksperyment w przestrzeni wolnej od RNaz;używane końcówki do pipet i probówki do PCR muszą być wolne od RNaz;i nosić jednorazowe rękawiczki i maski.

u Ten zestaw musi być używany z określonymi starterami do eksperymentów.Proszę wybrać specyficzne startery dla genu do amplifikacji zgodnie z potrzebami eksperymentu.

u Przed użyciem umieść 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman na lodzie, aby całkowicie się stopił, strzepnij i dobrze wymieszaj przed użyciem;przygotowanie systemu powinno odbywać się w łaźni lodowej, aby poprawić działanie zestawu i zwiększyć amplifikację PCR.

Stężenie wzorcowego RNA

RT-qPCR EasyTM (One Step)-Taqman:(1 pg-100 ng całkowitego RNA)/20 μl system.

Przewodnik po operacjach

A: Przygotowanie materiałów i odczynników

• Przygotuj przygotowaną matrycę RNA (zaleca się użycie zestawów serii Foregene Total RNA Isolation Kit do ekstrakcji i oczyszczania RNA), specyficzne startery (10 μM) oraz powiązane materiały eksploatacyjne i instrumenty.

Uwaga: Upewnij się, że RNA jest integralne i spróbuj użyć RNA wyekstrahowanego ze świeżych próbek.

• Umieść 2x RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman, ddH2O bez RNaz i 20x barwnik referencyjny ROX (jeśli to konieczne) na lodzie, aby naturalnie się stopił, a następnie wymieszaj ściankami probówki aż do użycia.

B: Przygotowanie systemu RT-qPCR

2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman jest wygodny i szybki w użyciu, w największym stopniu pozwala uniknąć zanieczyszczeń podczas pracy i błędów doświadczalnych spowodowanych wielokrotnym przygotowywaniem układu reakcyjnego.Używając tylko połowę objętości układu reakcyjnego (np. jeśli układ reakcyjny ma 20 μl, weź 10 μl roztworu 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman), dodaj odpowiednią ilość matrycy RNA i specyficzne startery i dodaj ddH2O bez RNaz do uzupełnienia objętości.Konkretne przygotowanie układu reakcyjnego RT-qPCR można znaleźć w Tabeli 1 poniżej.

Tabela 1: Przygotowanie systemu RT-qPCR

Uwaga: Forward Primer i Reverse Primer są starterami specyficznymi dla genu docelowego.System qPCR można dostosować do potrzeb eksperymentalnych i modelu PCR.Dla końcowego stężenia większości podkładów zalecamy 400nM.Proszę dostosować dozowanie konkretnego podkładu i sondy zgodnie z przygotowanym stężeniem zgodnie z naszym zalecanym stężeniem końcowym.W przypadku qPCR z systemem 50 μl, należy zapoznać się z systemem 20 μl, aby proporcjonalnie dostosować ilość odczynników.

1*: Wybierz odpowiednie stężenie końcowe barwnika referencyjnego ROX zgodnie z różnymi ilościowymi instrumentami PCR.Optymalne stężenie barwnika referencyjnego ROX dla popularnych maszyn do ilościowego PCR przedstawiono w poniższej tabeli:

C: Ustawienie systemu reakcji RT-qPCR

• Po przygotowaniu systemu RT-qPCR zgodnie z powyższą tabelą należy delikatnie wymieszać (można użyć końcówki pipety do delikatnego pipetowania; można też mieszać na worteksie i krótko wirować w celu zebrania płynu rozsypanego na ściance probówki lub korku probówki, i umieść na pojemniku na lód do późniejszego użycia).
• Zapoznaj się z ustawieniami programu reakcji RT-qPCR (Tabela 2), aby ustawić temperaturę i czas reakcji.

Uwaga: Aby zapewnić aktywność 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman i poprawić jego skuteczność amplifikacji, najlepiej przygotować system reakcyjny RT-qPCR po skonfigurowaniu programu aparatu PCR, aby program reakcji mógł być wprowadzone natychmiast po zakończeniu przygotowania systemu.

• Aby uzyskać najlepszy efekt qPCR, gradient PCR może być użyty do optymalizacji warunków reakcji dla różnych matryc i różnych starterów.

Uwaga: Zakres temperatury przedłużenia dla polimerazy Foregene Hotstar Taq DNA Polymerase zawartej w tym zestawie wynosi: 60-72 ℃, a najlepsza temperatura przedłużenia to 72 ℃.

Poniżej przedstawiono przykład warunków reakcji RT-qPCR.Zaleca się stosowanie metody dwuetapowej do reakcji PCR.Gdy stężenie matrycy jest zbyt niskie, aby spowodować nieswoistą amplifikację, niska wartość Tm startera prowadzi do niskiej wydajności amplifikacji lub słabej powtarzalności krzywej amplifikacji itp., zaleca się wypróbowanie trzyetapowej metody reakcji PCR.Patrz Tabela 2-1 (metoda dwuetapowa) i Tabela 2-2 (metoda trzyetapowa) w celu ustalenia warunków reakcji RT-qPCR.

Tabela 2-1: Ustawienie programu reakcji RT-qPCR (metoda dwuetapowa)

Tabela 2-2: Ustawienie programu reakcji RT-qPCR (metoda trzyetapowa)

1*: Czas odwrotnej transkrypcji można dostosować do potrzeb eksperymentalnych.Ogólne endogenne geny, takie jak β-aktyna, potrzebują tylko 10 minut;w celu wykrycia określonych genów ulegających ekspresji, czas odwrotnej transkrypcji można odpowiednio wydłużyć w razie potrzeby.

2*: Ustaw konkretny czas zgodnie z długością amplifikowanego fragmentu docelowego.Szybkość amplifikacji polimerazy Foregene HotStar Taq DNA wynosi 2 kb/min

Uwaga: Warunki reakcji PCR różnią się w zależności od warunków strukturalnych matrycy, starterów itp. W przypadku matryc RNA ze złożonymi strukturami drugorzędowymi zaleca się użycie 42℃ w pierwszym etapie odwrotnej transkrypcji.W konkretnej operacji konieczne jest zaprojektowanie optymalnych warunków reakcji zgodnie z określonymi warunkami, takimi jak wielkość fragmentu docelowego, sekwencja zasad amplifikowanego fragmentu oraz zawartość GC i długość startera, w tym temperatura hybrydyzacji, wydłużanie czas itp.

Przepływ pracy: